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血细胞计数单细胞成像

Jurkat Cell Imaging

流式细胞术

Cytometry Setup流式细胞术是一种成熟的方法，经常被生物学家和生物医学工程师用来描述悬浮在溶液中的单个细胞。在传统流式细胞术中，这些细胞通过微通道，用激光探测。激光与细胞的相互作用导致光子散射(获得粒度和尺寸)和/或光吸收和荧光发射(检测细胞上的分子标记)。最后，数据处理软件将散射和荧光信号结合起来，这样就可以从giv中收集到重要的统计数据。
(图1:流式细胞术图示。图片来自维基。)

应用细胞图像光度术

Cytometry Brightfield

图像细胞术与流式细胞术类似，但是细胞的图像是通过微通道获得的。这是通过两种主要的成像模式完成的:亮场成像和荧光成像。从亮场图像中，可以识别细胞的物理特征——大小、形状、不透明度、粒度、弹性等等。另一方面，利用荧光图像来识别每个细胞中存在的关键生物标记物的类型和分布。

(图2:图像流式细胞术的原型数据说明。图像来源于GEN)


高速图像血细胞计数

高速的图像-细胞分析数据捕获带来了新的物理挑战。首先，在微通道内快速移动的细胞需要能够超短曝光时间(微秒量级)的传感器。这对于消除图像模糊是必要的——图像模糊是在图像捕捉(或曝光)过程中物体移动太远时产生的一种成像伪影。不幸的是，短曝光时间带来了另一个成像挑战。短曝光时间限制了收集足够的光线来生成低光事件的高质量图像的能力。
特别是对于标记细胞，发出的信号相对于照相机的毫秒曝光时间来说是相对较低的。此外，当被激发时，标记细胞发射同位素，因此可用于成像的光子数量根据平方反比定律下降。这些事实使得要求帧率达到每秒1到2000帧甚至更高的荧光成像应用变得特别困难，或者在某些情况下甚至不可能。
目前，实现更高速度的策略是将相机与图像增强器相结合。此外，也有商业强化的sCMOS传感器(即，从PCO)能够在充分和降低分辨率分别100到7000帧/秒。这些系统的关键特征之一是低1.1 e-读出噪声。
在荧光成像是一个挑战，在高帧率和低曝光时间，亮场成像是限制速度的CMOS传感器。这是因为即使在亚微秒曝光的情况下，背光也能提供足够的光照，而且帧速率可能超过每秒100万帧。


机器视觉在生物医学中的应用

现在90%的医疗数据都是基于图像的。自动化需求的增加和基于视觉的系统需求的增加正在推动医疗保健社区的大规模采用。

图像细胞术——高速单细胞成像——被证明对大规模单细胞分析是有效的，因为它能够提高表型鉴定的准确性，同时保留细胞样本的固有特征。

一旦细胞被识别和分离，可以收集大量的定量指标来创建独特的形态配置文件。然后，可以将档案之间的相似性关联起来，以定义新的亚种群或识别特定疾病的表型。这种自动化可以缩短取样和诊断之间的时间。

以败血症为例，它是美国医院的头号死因。通过更快速的诊断和治疗，80%的败血症相关死亡可以得到预防。急诊室的医生使用一系列的实验室测试，x光，CT扫描，或核磁共振成像来确定感染的位置，但准确的分析需要时间。
利用图像细胞术，研究人员可以通过测量免疫细胞生物力学特性的变化来缩短诊断时间。利用粒细胞变形性作为区分脓毒症患者和健康献血者血液样本的表型生物标志物。相关的特征导致了“表达谱”的创建，可以与新的患者样本进行比较，并在十分钟内给出测试结果。


Phantom高速摄像机引领潮流

Image Cytometry Data

Vision Research已经设计了机器视觉摄像机，以满足图像细胞分析工程师的需要。为了使图像细胞处理技术达到最佳效果，高速相机需要更大的像素——通常在10到30微米之间。

在典型的细胞计数实验中，高达每秒10,000帧的帧率是很常见的。此外，更好的图像质量(可选择的位深度从8、10和12)，再加上更高的光敏感性，可以捕获更高质量的图像数据。

最值得注意的是，Phantom机器视觉高速摄像机是世界上最快的机器视觉摄像机，能够每秒传输高达9亿像素的图像数据到可存储22 TB以上的媒体上。


图3显示了典型的图像细胞分析数据，其中一个细胞快速通过微通道。相机能够捕捉细胞的大小、形状、转速，甚至还能分辨细胞内部的一些细节。本实验使用Phantom S990机器视觉流媒体高速摄像机进行。
图像流式细胞术也需要自动识别细胞表型，否则该技术的潜在效益就会受到限制。这种需求促使开发了用于高速成像的新软件。

在最近的一项实验中，Vision Research博士Kyle Gilroy开发了一个由聚苯乙烯微球(直径为25°m)组成的“模型”系统，在微流体通道中高速流动。当微球穿过通道时，使用Phantom S640机器视觉流媒体高速摄像机来监控微球的快速运动(摄像机的速度为每秒3300帧)。

然后使用SpicatekCytometry Microchannel的Marco Gajardo和Mikael Brommels开发的软件快速分析该数据，提取关键表型数据。典型数据的示例如图4所示。最引人注目的是，可以执行图像分析，并在捕获下一帧之前将结果数据报告给用户。


访问Spicatek网站，了解更多其软件详情。